آشنایی با کروماتوگرافی مایع (HPLC)

مفاهیم کلیدی در کروماتوگرافی

درتمامی روش‌های کروماتوگرافی، جداسازی بر پایه تفاوت مقداری آنالیت ( ماده مورد جداسازی ) در دو فاز ساکن و متحرک انجام می‌شود. این تفاوت ، در نهایت منجر به تشکیل تعادلی خواهد شد که آن را با پارامتری به نام ثابت توزیع (K) بیان می‌کنند. در این رابطه Cm و Cs به ترتیب نشان‌دهنده غلظت مولی آنالیت در فازمتحرک و فاز ساکن است.

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

از میان تکنیک‌های جداسازی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا  (High Performance Liquid Chromatography -HPLC)، بیشترین رشد و کارایی را داشته است و سالیانه میلیون‌ها دلار صرف خرید و فروش دستگاه‌ های HPLC در دنیا می‌شود. علت این رشد را می‌توان به حساسیت بالا، تعیین مقدار کمی با صحت بالا، قابلیت آنالیز نمونه ‌های غیر فرار و حساس به دما که با تکنیک کروماتوگرافی گازی امکان‌پذیر نیستند، نسبت داد.

فاز ساکن و فاز متحرک

در مورد قطبیت فاز‌های ساکن و متحرک یک قاعده کلی وجود دارد. طبق این قاعده، قطبیت حل‌‌شونده و فاز متحرک باید نزدیک به هم باشد، ولی با فاز ساکن اختلاف داشته باشد . ترتیب قطبیت در ترکیبات به صورت زیر است:

هیدروکربن <  اترها < استرها <  کتون‌ها <  آلدئیدها <  آمیدها <  آمین‌ها <  الکل‌ها

 
خصوصیات فاز متحرک در HPLC

• درصد خلوص بالا ( حلال‌هایی با درصد خلوص بسیار بالا، HPLC Grade، در بازار موجود است که قیمت بالایی نیز دارد)
• نقطه جوش بالاتر از دمای ستون (به خصوص در مواردی که با گرمکن (Oven) کار می‌شود)
• واکنش‌پذیری کم (Inertness)
• قابلیت تطبیق با آشکارساز

اجزاء و قسمت‌های مختلف دستگاه HPLC

1 ) مخازن حلال

که در آنها فاز متحرک و یا حلال‌های شستشو دهنده ستون ریخته شده است.

2 )  موتور یا پمپ

به منظور انتقال حلال و همچنین نمونه در فضای نسبتا طویل ستون، نیاز به ایجاد فشار در سیستم است که برای ایجاد آن حداقل از یک پمپ یا موتور استفاده می‌شود. حلال (فاز متحرک) توسط پمپ با سرعت و جریان ثابتی بر روی فاز ساکن حرکت داده می‌شود. فشار سیستم به اندازه (سایز) ذرات موجود در ستون، گرانروی (Viscosity) و سرعت جریان فاز متحرک بستگی دارد. بسته به نوع جداسازی، میزان سرعت جریان فاز متحرک تعیین می‌گردد. در مواردی که با تعدادی از آنالیت ‌ها مواجه هستیم، هر جزء جدا شده، خود را به صورت یک پیک در کروماتوگرام نهایی نشان می‌دهد. در سرعت جریان کمتر فاز متحرک، فاصله بین پیک ‌ها افزایش یافته و جداسازی بهتری خواهیم داشت. معمولا گفته می‌شود که در ستون‌هایی با قطر کمتر از  5mm، سرعت جریان نباید بالاتر از 2.5 ml/min باشد چرا که باعث صدمه زدن به ستون و کاهش عمر مفید آن می‌شود.

به عنوان فاز متحرک، مخلوطی از حلال‌ها در ازای یک حلال خالص می‌تواند به‌کار گرفته شود. نسبت اجزاء فاز متحرک در طی یک تزریق ممکن است ثابت باشد که در این صورت به آن روش ایزوکراتیک (Isocratic) می گویند. در حالتی دیگر که به آن روش گرادیانت (Gradient) گفته می‌شود، طی یک تزریق و با پیشرفت زمان، طبق برنامه‌ ای که از قبل برای سیستم تعریف شده است، درصد متفاوتی از دو یا چند حلال مخلوط شده و در سیستم توسط پمپ جریان می‌یابد.

3 ) تزریق‌کننده (Injector)

تزریق نمونه، بسته به نوع دستگاه، به دو شکل دستی و یا خودکار انجام می‌گیرد. در روش خودکار، نمونه در ظروف مخصوصی ریخته شده و در محل تعبیه شده در دستگاه قرار می‌گیرد. پس از اینکه اپراتور دستور تزریق را (از طریق نرم‌افزار) می‌دهد، نمونه توسط یک سرنگ به سیستم منتقل می‌شود. در روش دستی، از سرنگ ‌هایی با ظرفیت ‌های مختلف برای تزریق نمونه استفاده می‌شود. حجم نمونه تزریق شده (در هر دو روش)، به حجم حلقه نمونه ‌بردار (Loop) بستگی دارد و مقدار آن معمولاً در حد 5 تا 500 میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد این حلقه شده و پس ازآماده شدن سیستم به همراه فاز متحرک وارد ستون می‌شود.

4 ) ستون

 پس از تزریق، نمونه ابتدا وارد قسمتی به نام پیش‌ ستون (pre-column) یا ستون محافظ (Guard column) می‌شود. نقش این ستون، محافظت از ستون اصلی است.  طول این ستون معمولا در حد چند سانتی‌متر و جنس آن از فولاد ضد زنگ است.  ماده پرکننده (Packing) ستون محافظ از جنسی مشابه ماده پرکننده ستون اصلی است. هم جنس بودن نوع پرکننده این مزیت را دارد که اگر ماده‌ای که با ذرات ستون وارد واکنش شود در نمونه موجود باشد، در ابتدا در ستون محافظ به دام افتاده و ستون اصلی را دچار آسیب نمی‌کند. طول ستون ‌های اصلی دستگاه معمولا حدود 30-10 سانتی‌متر بوده و درون ستون را با موادی که به یکی از دو فرم پوسته ‌دار و یا متخلخل است، پر کرده‌اند. سایز این مواد پرکننده که بر کیفیت جداسازی تاثیر فراوانی دارد، متفاوت بوده و معمولا در حد 3 تا 5 میکرومتر است.

ستون می‌تواند قطبی و یا غیرقطبی باشد. از مرسوم‌ترین ستون‌های غیرقطبی می‌توان به  C18، اکتادسیل سیلان (ODS) اشاره کرد. جنس ستون‌ها از فولاد ضدزنگ (Stainless Steel) است. پس از ورود نمونه به ستون، براساس تفاوت قطبیت، اجزاء مختلف نمونه در زمان‌های متفاوتی با نام زمان بازداری (Retention Time) از یکدیگر جدا شده و برای تشخیص نوع ماده به سمت آشکارساز(Detector)  هدایت می‌شوند.

در نهایت پس از اتمام کار باید ستون را شستشو دهیم. برای شستشو، بسته به نوع ستون، حلال متفاوتی را با ترتیب خاص انتخاب می‌کنیم. برای مثال در ستون ‌های غیرقطبی پس از اتمام کار، ابتدا ستون را با یک حلال قطبی (معمولا آب) و سپس با یک حلال غیر قطبی (معمولا متانول) شستشو می‌دهند.

5 ) آشکارساز (Detector)

آشکارساز بر اساس نوع آنالیت انتخاب می‌شود. به طور کل یک آشکارساز خوب باید دارای ویژگی‌ های زیر باشد:

حساسیت بالا
غیرتخریبی بودن (Nondestructive) : در طول روند شناسایی، نمونه را تخریب نکند.
پاسخ خطی به غلظت در دامنه وسیع (برای سهولت در محاسبات)